• Unklare Normabweichungen im maschinellen Blutbild

• Verdacht auf primäre Knochenmarkerkrankungen (Leukämien, Lymphome etc.)

• Remissionskontrollen hämatologischer Erkrankungen

• Verdacht auf neoplastische Infiltration nicht-hämatopoetischer Organe bzw. Kompartimente (Leptomeningealraum, Peritoneum usw.)

Die Zytomorphologie von peripherem Blut und Knochenmark ist eine schnelle und preiswerte Methode, um richtungsweisende diagnostische Informationen zu hämatologischen Erkrankungen zu erhalten [1]. Insbesondere im Licht neuerer und teurerer Verfahren kommt ihr eine besondere Rolle bei der Indikationsstellung für weitergehende Analysen im Rahmen einer inhaltlich sinnvollen und wirtschaftlichen Stufendiagnostik zu. Ferner eignet sie sich als rasche orientierende Untersuchung von Punktionsmaterialien [5].

Die wichtigsten Kenndaten dieser Methode sind:

• Untersuchungsdauer: Die Untersuchungsdauer beträgt bei einer panoptischen Färbung ca. 15-30 Minuten. Bei Spezialfärbungen bzw. zytochemischen Färbungen richtet sich die Dauer der Untersuchung maßgeblich nach diesen. Die Zytomorphologie sollte innerhalb eines Tages abgeschlossen werden. Dies ist wichtig, um rasch andere Methoden zielgerichtet einzusetzen und eine Stufendiagnostik zu ermöglichen.

• Vor- und Nachteile: Die Vorteile des Verfahrens bestehen in seiner praktisch ubiquitären Verfügbarkeit, raschen Durchführbarkeit und den technisch geringen Kosten. Die hauptsächlichen Nachteile bestehen in der geringen Sensitivität (ca. 1:100), der langen Einarbeitungszeit und der hohen Erfahrungsabhängigkeit des Untersuchers.

Als Untersuchungsmaterial eignen sich peripheres Blut, Knochenmarkaspirat sowie flüssige Punktionsmaterialien (Liquor, Aszites, Pleuraflüssigkeit u.a.). Für alle Materialien gilt, dass sie im rasch präparierten Nativzustand sehr gut zu bewerten sind. Sie können jedoch auch mit dem Antikoagulanz Ethylendiamintetraacetat (EDTA) oder Citrat versetzt werden, was spätere Präparationen in vergleichbarer Qualität zulässt. Antikoaguliertes Material sollte innerhalb von 24 Stunden ausgestrichen und analysiert werden, dies gilt sowohl für das numerische Blutbild als auch für das Differenzialblutbild. Heparin ist als Antikoagulanz für zytomorphologische Untersuchung wegen Artefaktbildungen nicht geeignet. Ausgestrichene Knochenmarkausstriche sollten vor dem Färben zumindest 30 Minuten getrocknet haben. Das gilt unbedingt auch, wenn diese ungefärbt versendet werden sollen, bevor diese in den Versandcontainer verpackt werden.

Voraussetzung für eine aussagekräftige Untersuchung ist die Gewinnung von repräsentativem Material und eine fachgerechte Präparation. Bei allen Punktionen muss daher sichergestellt sein, dass das zu untersuchende Kompartiment getroffen wurde. Aus diesem Grunde sollte direkt das erste Aspirat für die zytomorphologische Analytik gewonnen werden, damit es später einer visuellen Kontrolle im Mikroskop unterzogen werden kann.

Die Präparation des Materials kann unverzüglich am Nativmaterial oder später an antikoaguliertem Material (EDTA oder Citrat) erfolgen. Bei peripheren Blutausstrichen ist darauf zu achten, dass ein abnehmender Dickegradient auf dem Objektträger mit Ausbildung einer so genannten Ausstrichfahne entsteht. Knochenmarkpräparate werden unmittelbar nach Aspiration (innerhalb weniger Sekunden, da das Aspirat sehr schnell gerinnen kann) oder besser noch mit Vorlegen von EDTA oder Citrat in der Spritze bis zu einem Zeitfenster von 24 Stunden als Ausstrich- oder als sogenannte Quetschpräparate angefertigt. Hierbei ist darauf zu achten, dass genügend Knochenmarkbröckel auf die Objektträger gelangen. Bei frustraner Aspiration sollten möglichst Abrollpräparate von einer nativen Stanzbiopsie angefertigt werden. Prinzipiell ist es erstrebenswert, mindestens 5 ml Blut- und Knochenmark zu erhalten. Andere Punktionsmaterialien sollten für die Zytomorphologie idealerweise rasch unpräpariert in das Labor gelangen, da sie dort häufig speziell aufgearbeitet werden (z.B. Zytozentrifugation). Im Zweifel ist Rücksprache mit dem beauftragten Labor zu halten.

Die Knochenmark-Präparate sollten mindestens 15 (bei zellreichen Knochenmarkausstrichen 30) Minuten lufttrocknen, insbesondere auch vor einem eventuellen Versand. Obligat ist die Durchführung einer panoptischen Färbung (z.B. nach Pappenheim), welche eine gute Übersicht über die verschiedenen Zellfraktionen erlaubt. Alle weiteren Färbungen ergeben sich aus deren Bewertung, siehe Tabelle 1:

Die Untersuchung der fertigen Präparate erfolgt an einem qualitativ hochwertigen Lichtmikroskop. Die Objektivausstattung sollte eine Übersichtsvergrößerung (10x oder 20x), eine mittlere Vergrößerung (40x oder 63x mit Öl) sowie eine hochauflösende Vergrößerung (100x mit Öl) beinhalten. Der Untersuchungsgang beginnt mit einer Orientierung über die Qualität des Materials und einer quantitativen Analyse der Zellverteilung (10X Objektiv ohne Öl). Danach werden im peripheren Blutausstrich mindestens 100 (-200) kernhaltige Zellen (Differenzialblutbild) sowie die Erythrozytenmorphologie bewertet. Im Knochenmark werden mindestens 200 (-500) kernhaltige Zellen (Myelogramm) kategorisiert. Abweichungen hiervon, z.B. bei ausgeprägter hämatopoetischer Hypoplasie, sind zu dokumentieren. Mit Ausnahme des Liquors erfolgt die Analyse anderer Punktionsmaterialien nicht nach einem festgelegten Prinzip, sondern richtet sich in erster Linie nach der Fragestellung.

Neben der quantitativen Analyse sollte eine möglichst genaue Beschreibung normabweichender qualitativer Zellmerkmale erfolgen. Auch Ausschlussfeststellungen (z.B. kein Nachweis knochenmarkfremder Zellen) können für die abschließende Beurteilung hilfreich sein. Letztere sollte so konkret wie möglich formuliert werden und kann auch Verweise auf weiterführende diagnostische Methoden enthalten.

Die quantitative (Zelldifferenzierung) und qualitative Analyse (z.B. Dysplasie, Erythrozytenmorphologie) kann durch eine entsprechend qualifizierte und ärztlich autorisierte Laborfachkraft erfolgen. Eine wertende Analyse (Befundinterpretation) muss durch einen Facharzt für Innere Medizin mit der Schwerpunktbezeichnung Hämatologie und Internistische Onkologie, einen Facharzt für Pathologie oder einen Facharzt für Laboratoriumsmedizin erfolgen. Der Befund muss die Unterschrift oder eine validierte elektronische Signatur eines Arztes tragen. Die regelmäßige Teilnahme an externen Qualitätskontrollen (Ringversuchen) ist erforderlich, eine Zertifizierung/Akkreditierung des Labors nach ISO 15189 ist wünschenswert. Die Empfehlungen der Richtlinienkommission der Bundesärztekammer (RiliBÄK) bzw. nationaler Fachorganisationen sind einzuhalten.

• Unklare Abweichungen im maschinellen oder mikroskopischen Blutbild [14]

• Verdacht auf primäre Knochenmarkerkrankungen (Leukämien, Lymphome etc.)

• Remissionskontrollen hämatologischer Erkrankungen bzw.

• Nachweis einer messbaren Resterkrankung (MRD)

• Verdacht auf neoplastische Infiltration nicht-hämatopoetischer Kompartimente (Liquorraum, Peritoneum, Pleurahöhle etc.)

• Verdacht auf andere klonale hämatopoetische Erkrankungen (z.B. PNH)

• Verdacht auf zellulären Immundefekt (z.B. HIV, common variable immunodeficiency, CVID))

• Lymphozytentypisierung aus broncho-alveolärer Lavage (BAL)

Die durchflusszytometrische Charakterisierung von Zellen ist eine wichtige Technik zur Messung physiologischer Zellpopulationen (z.B. Quantifizierung von CD4-positiven Helferzellen) sowie zur diagnostischen Einordnung von lymphatischen Neoplasien [12]. Aber auch zum Nachweis von myeloischen Zellen mit normalem oder pathologischen Granulations- oder Antigenexpressionsmuster ist dieses Verfahren etabliert. Ferner können auch Veränderungen erythrozytärer Zellen (z.B. paroxysmale Hämoglobinurie, Sphärozytose) detektiert werden.

Die wichtigsten Kenndaten dieser Methode sind:

• Untersuchungsdauer: Die Untersuchungsdauer beträgt bei einer Standardmessung ca. 60 Minuten. Bei speziellen Anwendungen kann sie darüber liegen.

• Vor- und Nachteile: Die Vorteile des Verfahrens bestehen in seiner raschen Durchführbarkeit, seiner guten Reproduzierbarkeit sowie seiner höheren Sensitivität gegenüber der Morphologie von bis zu 1:10⁵. Der hauptsächliche Nachteil besteht in der eingeschränkten Verfügbarkeit und den Kosten für Geräte und Antikörper, welche auf den notwendigen Technologiegrad zurückzuführen ist. Gerade auch durch die zunehmende Anwendung bei MDS und insbesondere MRD bei AML, ALL, Lymphomen und Plasmazellneoplasien ist eine gute technologische Ausstattung (Anzahl Farben) und eine große Expertise der Befunder zu fordern.

Als Untersuchungsmaterial eigenen sich sämtliche antikoagulierten und nativen Zell-Flüssigkeitssuspensionen. Der Transport erfolgt bei Raumtemperatur. Das Intervall zwischen Materialgewinnung und Analyse sollte bei antikoagulierten Materialien im Regelfall 48 Stunden nicht übersteigen, Nativflüssigkeiten (z.B. Liquor etc.) sollten innerhalb von 6 Stunden nach Entnahme untersucht werden. Spezielle Transportröhrchen für Liquor sollten erwogen werden.

Die Aufarbeitung der Materialien erfolgt nach Standardprozeduren. Im Mittelpunkt steht dabei die Inkubation der Zellsuspension mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder sonstigen Fluoreszenzfarbstoffen. Die Spezifität wird durch den verwendeten Antikörper oder den freien Farbstoff determiniert.

Bezüglich der zu untersuchenden Antigene oder Zielstrukturen existieren größtenteils Empfehlungen. Beispielhaft sei hier auf die Empfehlungen des European LeukemiaNet [15] und des EuroFlow-Konsortiums [12] verwiesen.

Die Durchführung der Analyse kann durch eine entsprechend qualifizierte und ärztlich autorisierte Laborfachkraft erfolgen. Wichtig ist, dass die Generierung der Quelldaten hochgradig von den Instrumenteneinstellungen abhängig ist und ein hohes Maß an gerätespezifischer Expertise erfordert. Aus diesem Grunde muss eine tägliche interne Qualitätskontrolle und ggf. Anpassung der Fluoreszenzkalibrierung erfolgen.

Die Befundinterpretation ist ebenfalls sehr stark von der zuvor durchgeführten Datenakquisition (sog. Gating) abhängig und muss durch einen Facharzt/Fachärztin für Innere Medizin mit der Schwerpunktbezeichnung Hämatologie und Internistische Onkologie, einen Facharzt/Fachärztin für Pathologie oder einen Facharzt/Fachärztin für Laboratoriumsmedizin erfolgen. Der Befund muss die Unterschrift oder eine validierte elektronische Signatur eines Arztes/Ärztin tragen. Die regelmäßige Teilnahme an externen Qualitätskontrollen (Ringversuchen) ist erforderlich, eine Zertifizierung/Akkreditierung des Labors ist wünschenswert.

• Nachweis oder Ausschluss hämatologischer Erkrankung mit bekannten rekurrenten Chromosomenanomalien

• Diagnose und Klassifikation von Erkrankungen mit spezifischen zytogenetischen Veränderungen

• Erhebung von Prognoseparametern bei Myelodysplasien, Leukämien und Lymphomen

• Remissionskontrollen hämatologischer Erkrankungen (Cave: Sehr eingeschränkte Sensitivität)

Zytogenetische Untersuchungstechniken sind bei der Diagnostik und Prognostik hämatologischer Erkrankungen fest etabliert. Viele zytogenetische Aberrationen haben laut der aktuellen WHO-Klassifikation entitätsdefinierenden Charakter oder dienen als wichtiger Leitbefund [17]. Darüber hinaus kann die Zytogenetik entscheidende prognostische Informationen liefern. Man unterscheidet bei den Analysen: a) Zytogenetik, d.h. Untersuchung des vollständigen Chromosomensatzes an Metaphasen (Standard: 20 Karyogramme nach ISCN (international system for human cytogenetic nomenclature)), b) Untersuchung einzelner Loci per Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), welche in der Regel an Interphasen durchgeführt wird (auch an Metaphasen z.B. sog. painting, oder auch als 24-Farben-FISH möglich). Der Karyotyp kann umfassend Auskunft über strukturelle (z.B. Translokationen) und numerische (Aneuploidie) Anomalien geben, ist als Methode aber relativ wenig sensitiv (ca. 1:25-50). FISH-Untersuchungen liefern dagegen nur Informationen zum untersuchten Chromosomenlocus, sind in der Regel jedoch etwas sensitiver (ca. 1:100).

Die wichtigsten Kenndaten dieser Methode sind:

• Untersuchungsdauer: Die Untersuchungsdauer beträgt bei einer klassischen Chromosomenanalyse 3-15 Tage. FISH-Analysen können innerhalb von 1-2 Tagen erfolgen oder aber im Rahmen von dringlichen Direktpräparationen innerhalb weniger Stunden (z.B. für PML::RARA oder BCR::ABL1).

• Vor- und Nachteile: Die Vorteile des Verfahrens bestehen aus seinem sehr gut gesicherten diagnostischen und prognostischen Stellenwert. Die Nachteile bestehen aus der Notwendigkeit viabler maligner Zellen beim Eintreffen im Labor für die Kulturen der Zytogenetik, verhältnismäßig langer Untersuchungsdauer, der geringen Sensitivität (1:20 bis 1:500) und der sehr starken Erfahrungsabhängigkeit der Untersucher.

Da die klassische Chromosomenanalyse als Ausgangsmaterial lebende Zellen benötigt, kommt dem richtigen Antikoagulanz und einem raschen Probentransport hier besondere Bedeutung zu. Die Untersuchung ist prinzipiell nur an Heparin-antikoaguliertem Material möglich. Um die Absterberate der Zellen während des Transportes möglichst gering zu halten, sollten diese bei Raumtemperatur und innerhalb von 24 (-48) Stunden in das zytogenetische Labor kommen. Generell ist die Zytogenetik umso sicherer auswertbar, je kürzer die Transportzeiten sind. FISH-Analysen an Interphasekernen können zwar auch an EDTA-antikoaguliertem Material durchgeführt werden, aus Gründen der Flexibilität und Einfachheit empfiehlt es sich jedoch, diese aus demselben Material wie für die klassische Chromosomenanalyse durchzuführen. Die Materialabnahme muss in ein steriles Gefäß erfolgen. In der Regel sind 2-5 ml Knochenmark oder 10-20 ml Blut erforderlich, größere Mengen steigern die Sensitivität und Aussagekraft jedoch erheblich.

Gemäß der aktuell gültigen WHO- und ICC-Klassifikation ist eine Vielzahl von hämatologischen Erkrankungen über rekurrente chromosomale Anomalien definiert. Hierzu zählen u.a. (Auswahl), siehe Tabelle 4:

Neben diesen entitätsdefinierenden Chromosomenveränderungen existieren zahlreiche zytogenetische Befunde, welche zusätzlich zu den übrigen Untersuchungen diagnostische Schlüsselinformationen für die Diagnosestellung liefern. Hierzu zählen u.a. (Auswahl), siehe Tabelle 5:

Schließlich konnte in den vergangenen Jahren gezeigt werden, dass zytogenetische Befunde eine überragende Bedeutung bei der Prognoseeinschätzung hämatologischer Entitäten haben. Auf eine detaillierte Darstellung wird hier aus Gründen der Übersichtlichkeit verzichtet.

Bei der Chromosomenanalyse wird angestrebt, mindestens 20 Metaphasen zu analysieren. Wird eine durchgehende klonale Aberration nachgewiesen, ist eine Untersuchung von zumindest 10 Metaphasen ausreichend. Bei der FISH-Analyse sollten mindestens 100 Interphasekerne untersucht werden. Die Ergebnisse der Chromosomenanalyse und der FISH-Analyse werden nach der aktuellen internationalen Nomenklatur (ISCN) [10] in ihrer jeweils gültigen Fassung angegeben.

Die Durchführung der Analyse kann durch eine versierte und ärztlich autorisierte Laborfachkraft erfolgen. Die Kontrolle der erhobenen Chromosomenbefunde sowie die Befundinterpretation sollten durch eine(n) Fachhumangenetiker(in), eine(n) Facharzt/Fachärztin für Humangenetik oder eine vergleichbar qualifizierte Person erfolgen. Der Befund muss die Unterschrift oder eine validierte elektronische Signatur eines Arztes/Ärztin tragen. Die regelmäßige Teilnahme an externen Qualitätskontrollen (Ringversuchen) ist erforderlich, eine Zertifizierung/Akkreditierung des Labors wünschenswert.

• Nachweis oder Ausschluss hämatologischer Erkrankung mit bekannten rekurrenten molekularen Aberrationen

• Erhebung von Prognoseparametern bei Myelodysplasien, Leukämien, myeloproliferativen Neoplasien und Lymphomen

• Remissionskontrollen hämatologischer Erkrankungen, v.a. Nachweis einer messbaren Resterkrankung (MRD)

• Bestimmung des hämatopoetischen Chimärismus nach allogener Stammzelltransplantation

Molekulargenetische Untersuchungstechniken besitzen einen sehr gut etablierten Stellenwert bei der Diagnostik, Prognostik und Verlaufsbeobachtung hämatologischer Erkrankungen [13]. Zum einen basieren sie noch auf konventionellen Polymerasekettenreaktionen (PCR), andererseits werden zunehmend moderne genomische Verfahren eingesetzt, welche die simultane und quantitative Analyse einer großen Zahl von Genen bis hin zur vollständigen Untersuchung ganzer Genome, Exome, Transkriptome etc. erlauben (NGS = next generation sequencing). Auf Grund dieser enormen analytischen Bandbreite, muss die Indikation für die Bestimmung verschiedener Parameter sehr sorgfältig und aus der klinischen Fragestellung kombiniert möglichst mit Befunden aus der Zytomorphologie und Durchflusszytometrie gestellt werden. Auch ein Abgleich mit Befunden der Zytogenetik ist wünschenswert.

Die wichtigsten Kenndaten dieser Methode sind:

• Untersuchungsdauer: Nach Vorbereitung der Probe beträgt die reine Untersuchungsdauer bei einer konventionellen PCR 2-4 Stunden. Verfahren, welche DNA-Sequenzierungen mit einschließen können, rein technisch 24h (kurze DNA-/RNA-Abschnitte) bis zu ein bis zwei Wochen (Genomanalysen) dauern. Der zusätzliche bioinformatische Aufwand der Auswertung muss hinzugerechnet werden und ist bei größerem Umfang der Daten nicht unerheblich.

• Vor- und Nachteile: Die Vorteile des Verfahrens bestehen in seiner unübertroffenen Spezifität und Sensitivität. Die hauptsächlichen Nachteile bestehen aus dem außerordentlich hohen Spezialisierungsgrad, bei den heute möglichen NGS-Ansätzen der notwendigen Zusammenarbeit von Bioinformatikern, Molekularbiologen und Ärzten und den Kosten.

Als Untersuchungsmaterial eignet sich prinzipiell jede zellhaltige Körperflüssigkeit, insbesondere peripheres Blut, Knochenmarkaspirate und Punktate. Ethylendiamintetraacetat (EDTA) ist für gerinnbare Flüssigkeiten das Antikoagulanz der Wahl, anderer Antikoagulanzien wie Heparin können jedoch auch verwendet werden. Auf Grund der kurzen Halbwertzeit von Ribonukleinsäure (RNS) muss für RNS-basierte Analysen ein rascher Transport (innerhalb 24 (-48h)) bei Raumtemperatur in das Untersuchungslabor sichergestellt werden. Alternativ können Abnahmegefäße mit Stabilisatorzusätzen Verwendung finden, deren Einsatz ist jedoch noch nicht für alle nachfolgenden Methoden etabliert.

Während die gezielte Untersuchung pathogener somatischer (erworbener) Genaberrationen keinen besonderen Regularien unterliegt, bedürfen Keimbahnanalysen gemäß Gendiagnostikgesetz (GenDG) grundsätzlich der gesonderten Aufklärung und schriftlichen Zustimmung durch den Patienten/Patientin.

Viele molekulargenetische Nachweisverfahren basieren auf dem Prinzip der Polymerasekettenreaktion (PCR). Die hierbei entstehenden Amplifikate können durch elektrophoretische oder fluoreszenzgestützte Methoden direkt dargestellt werden. Letztere erlauben auch eine akkurate Quantifizierung im Ausgangsmaterial. Methodisch gibt es in der Molekulargenetik zwei Problemfelder: Falsch-negative Ergebnisse durch Nukleinsäuredegradation und falsch-positive Ergebnisse durch Kreuzkontamination. Um erstere zu reduzieren ist das stete Mitführen einer probenspezifischen Positivkontrolle (interne Kontrolle) obligat. Dies kann gleichzeitig als quantitative Referenz genutzt werden. Kreuzkontaminationen sollten durch eine strikte räumliche Trennung von präparativen und analytischen Schritten ausgeschlossen werden. Zusätzlich besteht die Möglichkeit, Uracil-haltige kontaminierende Amplifikate durch einen Verdau mit Uracil-DNA-Glykosylase zu eliminieren.

In zunehmendem Maße kommen heute Sequenzierungstechniken zur Anwendung. Diese basieren z.T. noch auf dem Kettenabbruchprinzip nach Sanger. Prinzipiell ist eine doppelsträngige Sequenzierung zu bevorzugen, welche die Fehlerwahrscheinlichkeit des Verfahrens reduziert. Der Abgleich der ermittelten Nukleinsäurensequenz (heute Varianten genannt) mit öffentlichen Datenbanken erfordert spezielle Expertise, insbesondere, wenn sie variable Genregionen (z.B. Immunglobulin-Ketten) betrifft.

Eine neue Entwicklung innerhalb der Molekulargenetik ist die Anwendung von genomischen Hochdurchsatzverfahren, die die gleichzeitige (parallele) Sequenzierung einer Vielzahl von Genabschnitten oder Genen oder sogar des gesamten Genoms ermöglichen. Obwohl diese Verfahren wirtschaftlich immer erschwinglicher, methodisch immer einfacher und zeitlich immer schneller werden, handelt es sich bisher noch um eine Methodik, die eine hochkomplexe Datenanalyse nach sich zieht. Zudem ist der klinische Stellenwert speziell zur Prognose einiger neuer molekularer Aberrationen noch nicht geklärt, so dass eine wichtige Aufgabe für die nahe Zukunft sein wird, die diagnostische und prognostische Wertigkeit jeder einzelnen Aberration weiter zu klären sowie die methodischen Voraussetzungen (z.B. Sensitivität) festzulegen. Ob die sog. Sanger-Sequenzierung (Sensitivität ca. 10-20%) oder das NGS (Sensitivität 2-5%) Anwendung findet, ist bisher dem jeweiligen Labor unter Berücksichtigung der üblichen Qualitätskontrollen, Ringversuche und ggf. Akkreditierung zu überlassen. Das NGS hat dabei viele Vorteile wie z.B. auch die genaue Beschreibung der Tumorlast (variant allele frequency = VAF).

Die Zahl molekulargenetischer Läsionen, die eine diagnostische oder prognostische Bedeutung haben, nimmt stetig zu. Nicht alle sind jedoch bereits klinisch hinreichend validiert. Veränderungen mit gesichertem Stellenwert (Auswahl) sind in Tabelle 6 zusammengefasst.

Die Durchführung der Analyse kann durch eine versierte und ärztlich autorisierte Laborfachkraft erfolgen. Die Kontrolle der erhobenen Befunde sowie die Befundinterpretation sollten durch eine(n) Fachhumangenetiker(in), eine(n) Facharzt/Fachärztin für Humangenetik oder eine vergleichbar qualifizierte Person (z.B. Molekularbiologen oder Molekularpathologen, ggf. mit Unterstützung durch Bioinformatiker) erfolgen. Der Befund muss die Unterschrift oder eine validierte elektronische Signatur eines Arztes tragen. Die regelmäßige Teilnahme an externen Qualitätskontrollen (Ringversuchen) ist erforderlich, eine Zertifizierung/Akkreditierung des Labors sehr wünschenswert.

Wenn im Rahmen der Erstdiagnose einer hämatologischen Systemerkrankung die Untersuchung der Knochenmarkzytologie angestrebt wird, ist es generell empfehlenswert, auch eine Knochenmarkstanzbiopsie zu gewinnen, um ein möglichst vollständiges Bild einer Knochenmarkbeteiligung der Erkrankung zu gewinnen [11]. Spezielle Indikationen für die Gewinnung einer Knochenmarkshistologie sind (Auswahl):

• Ausmaß einer Knochenmarkinfiltration bei Leukämien und MDS [9], Ausmaß der Infiltration und Topographie bei Lymphomen und beim Multiplen Myelom im initialen Staging oder zur Beurteilung des Remissionsgrades nach Therapie sowie Bestimmung des Anteils der verbliebenen Resthämatopoese

• Diagnostik myeloproliferativer Neoplasien, speziell auch bei Punctio sicca (Beurteilung des Fibrosenachweises und -grades z.B. bei Präfibrotischer und Primärer Myelofibrose, Haarzell-Leukämie, etc.)

• Infiltrate eines klassischen Hodgkin-Lymphoms

• Diagnostik fokaler Prozesse im Knochenmark (Metastasen solider Tumoren, Nachweis einer granulomatösen Erkrankung, etc.)

Histopathologische Untersuchungen des Knochenmarks, insbesondere aber auch von soliden Geweben, wie Lymphknoten, stellen nach wie vor bei vielen hämatologischen Entitäten, v.a. bei malignen Lymphomen, den diagnostischen Goldstandard dar. Das Verfahren ist langjährig etabliert und bei der Untersuchung solider Gewebe praktisch konkurrenzlos. Ergänzt wird es heutzutage durch immunhistochemische und molekularpathologische Techniken. Als einziges der hier aufgeführten Verfahren erlaubt es Feststellungen im geweblichen Kontext. Viele Entitäten sind in der derzeit gültigen WHO-Klassifikation sehr detailliert charakterisiert und allgemeingültig definiert.

Die wichtigsten Kenndaten dieser Methode sind:

• Untersuchungsdauer: Die Untersuchungsdauer variiert in Abhängigkeit von Material und Fragestellung zwischen wenigen Stunden (sog. Schnellschnitt) und mehreren Tagen (z.B. komplexe immunhistochemische und molekulare Untersuchungen an Knochenmark und Lymphknoten).

• Vor- und Nachteile: Die Vorteile des Verfahrens bestehen in seiner langjährigen Etablierung und insbesondere der sehr guten Spezifität. Die hauptsächlichen Nachteile bestehen aus der hohen Erfahrungsabhängigkeit sowie der hieraus resultierenden sehr beschränkten Standardisierungsmöglichkeit.

Voraussetzung für eine aussagekräftige histologische Untersuchung einer Knochenmarkstanze ist die Gewinnung von repräsentativem Material. Die Gewinnung des Stanzzylinders erfolgt in der Regel im Bereich der Spina iliaca posterior superior, die Länge des Stanzzylinders sollte mindestens 1,0 cm, wenn möglich aber 2,0 cm betragen. Mit der Übersendung der Knochenmarksstanze an ein Institut für Pathologie sollten auch alle relevanten klinischen Angaben (Blutbild, Knochenmarkszytologie, Vorerkrankungen, etc.) und insbesondere eine klinische Fragestellung übermittelt werden. Zur Fixierung wird üblicherweise neutral-gepuffertes Formalin verwendet, in der Pathologie folgt dann eine Paraffineinbettung, die zunächst eine Entkalkungsprozedur erforderlich macht. Diese Aufarbeitung führt, beispielsweise im Gegensatz zu einer Einbettung in Kunstharze, zu einer weitgehenden Erhaltung der Oberflächenantigene der Knochenmarkszellen, die für häufige immunhistochemische Fragestellungen wichtig ist.

Obligat an Knochenmarksstanzbiopsaten ist die Durchführung einer Hämatoxylin-Eosin (HE-)-Färbung, ggf. auch einer Giemsa-Färbung, welche eine gute Übersicht über die verschiedenen Zellpopulationen im Knochenmark erlauben. Die Untersuchung erfolgt an einem qualitativ hochwertigen Lichtmikroskop durch eine(n) Ärztin/Arzt für Pathologie, der/die spezielle Erfahrung in der hämatopathologischen Diagnostik aufweist. Der Knochenmarksbefund sollte Angaben zur Zellularität, zur topographischen Verteilung der zellulären Elemente sowie Einschätzungen zur Zellmorphologie erhalten und natürlich pathologische Veränderungen/Infiltrate beschreiben. Für viele Fragestellungen (z.B. Subklassifikation eines Lymphominfiltrates) sind immunhistochemische Untersuchungen erforderlich, gelegentlich müssen molekulare Untersuchungen (z.B. Klonalitätsanalysen bei der Frage einer diskreten Knochenmarksinfiltration durch ein Lymphom) durchgeführt werden.

Die Durchführung der Präanalytik kann durch eine versierte und ärztlich autorisierte Laborfachkraft erfolgen. Die Befunderhebung sowie die Befundinterpretation müssen durch einen Facharzt für Pathologie erfolgen. Der Befund muss die Unterschrift oder eine validierte elektronische Signatur eines Arztes tragen. Die regelmäßige Teilnahme an externen Qualitätskontrollen (Ringversuchen) ist erforderlich, eine Zertifizierung/Akkreditierung des Labors wünschenswert.